細胞培養の基本がわかる！細胞の種類・培養方法・注意点・課題・技術動向まで解説

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「細胞培養」とは、生体から取り出した細胞を、体外の人工的な環境下で維持・培養し、必要に応じて増殖させる技術のことです。生命科学の基礎研究から、画期的な新薬の開発、そして最先端の再生医療に至るまで、今日のバイオテクノロジーにおいて根幹をなす不可欠な基盤技術となっています。

私たちの体は数十兆個もの細胞から構成されていますが、それらの細胞が単体でどのように働き、病気がどのようにして起こるのかを分子レベルで解明する上で、生体という複雑なブラックボックスから細胞を取り出し、体外で安定して育てる技術は重要な研究手法の一つです。

本記事では、細胞培養に関する基礎知識から、近年注目を集めている技術まで、初心者の方にもわかりやすく解説していきます。

１．細胞の種類（分類）

細胞培養で扱う細胞は、培養時の接着性や分化の状態などによって分類できます。
ここでは、培養時の接着性による「接着性細胞」「浮遊性細胞」と、分化の状態による「幹細胞」「分化細胞」について解説します。
それぞれの特性を正確に理解することは、目的に応じた適切な培養方法を選択する上で非常に重要です。

（1）接着性細胞

生体内では細胞外マトリックス（ECM）や他の細胞との接着を伴って存在し、培養下では、培養容器の底面などに接着して生存・増殖するタイプの細胞です。

細胞培養においては、プラスチック製のシャーレやフラスコなどの培養容器の底面に付着して生存・増殖するものが多くあります。多くの接着依存性細胞では、足場から離れると「アノイキス」と呼ばれる細胞死が誘導されることがあるため、足場の質が非常に重要になります。

代表的なものとして、皮膚を構成する線維芽細胞や上皮細胞、血管内皮細胞などが挙げられます。

（2）浮遊性細胞

リンパ球などの血液系細胞や一部の白血病由来の細胞株のように、特定の足場を必要とせず、培地中に浮遊した状態で生存・増殖する細胞です。

接着性細胞のように容器から剥がすための酵素処理（トリプシン処理など）が不要であり、培養液をかき混ぜながら育てるタンク培養など、浮遊培養に適した細胞株では、比較的容易に大量培養へのスケールアップが可能であるという産業上の大きな利点を持っています。

（3）幹細胞と分化細胞

すでに特定の機能と形態を持つに至った「分化細胞」に対し、特定の細胞種へ変化（分化）する能力（分化能）と、幹細胞としての性質を維持しながら分裂を繰り返す能力（自己複製能）を併せ持つのが「幹細胞」です。

幹細胞の種類によって、分化できる細胞の範囲は異なります。
代表的な幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）、骨髄などに存在する間葉系幹細胞などが挙げられます。
特にiPS細胞は、患者自身の皮膚や血液などの体細胞から作製できるため、ES細胞で問題となる倫理的課題を回避しやすく、自家移植では免疫拒絶反応のリスクを低減できる可能性がある細胞として、再生医療や創薬研究の中心的な役割を担っています。

［※関連記事：幹細胞による再生医療の基本がわかる！多分化能幹細胞・多能性幹細胞とは？］

【表1　代表的な細胞の種類と特徴】

２．細胞培養の種類

細胞培養では、細胞の由来や継代の状態に応じて、初代培養や細胞株を用いた培養などが行われます。
ここでは、代表的なものとして「初代培養」と「細胞株の培養」について解説します。
研究や生産の目的に合わせて、これらを適切に使い分ける必要があります。

（1）初代培養

生体組織から直接細胞を採取し、必要に応じてタンパク質分解酵素（コラゲナーゼなど）を用いて組織から細胞を分離して開始する培養のことを「初代培養（プライマリーカルチャー）」と呼びます。

初代培養で得られた細胞は、生体内に存在していた時の本来の性質や機能を色濃く残しているため、薬物動態に関する研究や毒性試験など、生体に近い反応を評価するモデルとして有用です。
しかし、多くの正常な体細胞では分裂できる回数に限界があり、継代を重ねると次第に老化して増殖を停止してしまうため、長期的な維持や均一な大量調製が難しいという欠点があります。

（2）継代培養と細胞株の培養

細胞が適切な密度まで増殖した際、過密化や栄養の枯渇を防ぐため、必要に応じて細胞を剥離し、その一部を新しい容器に移し替えて培養を続ける操作を「継代培養」と呼びます。

初代培養から継代された培養細胞は、一般に「細胞株（セルライン）」と呼ばれます。
細胞株には増殖回数に限界があるものと、ウイルス感染や人為的な遺伝子操作、自然発生的な変化、あるいは腫瘍由来であることなどによって長期間増殖できる「連続細胞株（不死化細胞株）」があります。子宮頸がん由来の「HeLa細胞」や、チャイニーズハムスター卵巣由来の「CHO細胞」などが有名です。HeLa細胞などの連続細胞株は、世界中の研究室で基礎研究などに広く利用されています。また、CHO細胞は、抗体医薬品などのバイオ医薬品の製造に広く利用されています。

３．細胞培養の基本的な手法

細胞を体外の環境で安全かつ効率的に育てるためには、生体内と似た環境を人工的に再現し、それを一定に維持するための基本的な手法と専門の設備が必要不可欠です。

（1）培養環境の構築と必要な機器

細胞は温度やpHのわずかな変化に対して非常にデリケートです。そのため、温度、湿度、二酸化炭素（CO₂）濃度が厳密に管理された「CO₂インキュベーター（培養器）」の中で育てられます。哺乳類の細胞を培養する場合、一般的に温度は体温に近い37℃に設定されます。また、CO₂濃度は、培地に含まれる重炭酸塩との平衡によってpHを適切な範囲に保つために調整され、多くの培養条件では5%程度に設定されます。ただし、適切なCO₂濃度は培地の組成によって異なります。

さらに、無菌操作を行うための「バイオセーフティキャビネット」、細胞の形態や密度を観察する「位相差顕微鏡」が日々の作業に必須の機器となります。

［※関連記事：バイオリアクターの基礎をやさしく解説］

（2）培地の役割と成分

細胞が成長し増殖するための栄養源であり、細胞を取り巻く環境そのものとなるのが「培地（ばいち）」です。
基本となる液体培地には、アミノ酸、ビタミン、糖類（グルコースなどエネルギー源）、無機塩類が理想的なバランスで含まれています。

これに加えて、細胞の増殖や生存を強力にサポートするために、ウシ胎児血清（FBS）などの動物由来の血清（様々な成長因子やホルモン、接着因子を含む）を5〜10%程度添加する方法が従来から広く用いられています。
しかし近年では、動物愛護（3R）の観点や、血清のロット間差による実験結果のばらつき、未知のウイルスなどの混入リスクを低減する目的から、血清を一切含まない「無血清培地」や、すべての成分とその濃度が明らかになっている「化学組成既知培地（chemically defined medium）」の開発・利用が進んでいます。

（3）細胞の増殖と増殖曲線

細胞が時間とともにどのように増えていくか（増殖の動態）を把握するためには、「増殖曲線」を作成して評価することが重要です。
細胞の増殖プロセスは、代表的には以下のようなフェーズに分けて考えることができます（図1）。

① 誘導期（遅滞期）

細胞が新しい培地や培養環境に適応するための準備期間です。
酵素処理によるダメージからの回復や、新たなタンパク質の合成が行われており、細胞分裂は活発ではなく、全体の細胞数はほとんど増加しません。

② 対数増殖期

細胞が新しい環境に適応し、活発に細胞分裂を行い、細胞数が指数関数的に増加する期間です。
細胞の生理的活性が最も高く、均一な状態にあるため、各種の実験や次の容器へ移す継代培養を行うのに最適なタイミングです。

③ 定常期

培地中の栄養素や成長因子が枯渇し、同時に細胞の代謝産物（乳酸やアンモニアなどの老廃物）が蓄積することで環境が悪化し、細胞の増殖速度が低下または停止し、細胞数が頭打ちになる期間です。
条件によっては、細胞の増殖と死滅が均衡する場合もあります。正常な接着性細胞の多くでは、細胞同士が接触することで増殖が抑制される「接触阻止」も働きます。

④ 死滅期

環境の悪化がさらに進み、細胞が次々と死滅していく期間です。
全体の生細胞数が急速に減少するため、この状態になる前に培地交換や継代を行う必要があります。

この増殖曲線を正確に理解し、定常期に入る前の対数増殖期に、細胞種に応じた適切なタイミングで処理を行うことが、健全な細胞を長期間維持するために重要となります。

【図1　細胞増殖曲線の例】

４．細胞培養での注意点

細胞培養を成功に導くためには、高度な技術的スキルだけでなく、日々の細心の注意と徹底したリスク管理が欠かせません。わずかな気の緩みが、数ヶ月の努力や貴重なサンプルを無駄にする可能性があります。

（1）コンタミネーション（汚染）の徹底防止

細胞培養における最大の敵は、細菌、真菌（カビや酵母）、マイコプラズマなどの微生物によるコンタミネーション（汚染）です。これらの微生物は、培養細胞の増殖や代謝などに影響を与え、実験結果の信頼性を損なったり、場合によっては細胞を死滅させたりします。

コンタミネーションを防ぐためには、培養容器を開けて行う操作などを、適切に管理されたバイオセーフティキャビネット内で無菌的に行い、使用するピペットや容器には滅菌済みのものを使用し、必要に応じて試薬をフィルターろ過するなど、無菌状態を維持する必要があります。
また、作業者の手や衣服、呼気からの混入を防ぐため、入念な手洗いやアルコール消毒の徹底、マスクと適切な保護具の着用が強く求められます。

（2）マイコプラズマ汚染と交差汚染のリスク

微生物の中でも、マイコプラズマはサイズが非常に小さく（0.1〜0.3µm）、一般的な除菌フィルターをすり抜けてしまうことがあります。さらに、光学顕微鏡では発見が困難で、培地が著しく濁るといった明確なサインも出にくいため、「サイレントキラー」とも呼ばれています。気づかないうちに細胞の代謝や遺伝子発現、増殖速度に異常をもたらすため、定期的なPCR検査や専用の生化学的キットによるモニタリングが不可欠です。

また、異なる種類の細胞が誤って混入してしまう「交差汚染（クロスコンタミネーション）」も深刻な問題です。過去には、多くの研究で用いられていた細胞株が、実は非常に増殖力の強いHeLa細胞に入れ替わっていたという事例が多数報告され、大きな問題となりました。複数の細胞株を同じキャビネット内で同時に扱わない、ピペット類を共有しないなどの運用ルールを徹底する必要があります。

５．二次元培養と三次元培養

細胞を育てる「足場」の空間的な広がり方によって、細胞の振る舞いや得られる実験データは大きく変わります。近年、より生体に近い環境を体外で再現しようとする動きが加速しています。

（1）二次元培養（2D培養）の特徴

平らなプラスチック製のシャーレやマルチウェルプレートの底面に細胞を単層（シート状）で貼り付けて育てる、一般的な手法です（図2）。顕微鏡による細胞の形態観察が極めて容易であり、操作が単純でコストも低く抑えられるため、基礎研究から大規模な薬剤スクリーニングまで幅広く普及しています。

しかし、細胞が人工的な平面上で培養されるため、細胞の形態や極性、細胞間・細胞外マトリックスとの相互作用が生体内とは異なる場合があり、立体的な構造を持つ実際の生体内の状態とは異なる遺伝子発現パターンや薬剤応答を示してしまうという根本的な欠点が存在します。こうした違いは、培養細胞では効果が見られた薬剤が、動物やヒトでは同様の効果を示さない場合がある一因と考えられています。

【図2　細胞の二次元培養の例】

（2）三次元培養（3D培養）の特徴

二次元培養の限界を克服し、生体内の環境により近づけるため、細胞を立体的に配置して育てる手法が三次元培養です。代表的な手法として、細胞同士が自己凝集して密集した球状の塊を作る「スフェロイド（細胞塊）」培養や、コラーゲンやマトリゲルといった細胞外マトリックスを模したゲルの中に細胞を埋め込んで立体的に増殖させる手法、あるいは足場となるスポンジ状の多孔質材料（スキャフォールド）を用いる手法などがあります（図3）。

三次元培養では、細胞同士の立体的な相互作用が可能になり、生体内の組織に近い機能や、薬剤応答を示す場合があります。そのため、創薬における毒性試験や抗がん剤のスクリーニングにおいて、より生体に近いデータを得るための技術や、動物実験の削減・代替に貢献する可能性のある技術として、研究・利用が進んでいます。

【図3　細胞の三次元培養の例】

６．細胞培養の課題

テクノロジーの進化により細胞培養技術は飛躍的な発展を遂げていますが、現在でも乗り越えるべき重要な課題がいくつか存在しており、日夜研究が進められています。

（1）生体内微小環境の完全な再現

従来の二次元培養や基本的な三次元培養技術が普及した現在でも、実際の生体組織が持つ複雑な環境（生体内微小環境）を完全に体外で再現することは大きな壁となっています。

私たちの体内では、細胞は単独で存在しているわけではなく、血管網を通じた絶え間ない栄養と酸素の供給、老廃物の排出、免疫細胞との相互作用、さらには血流などの力学的なストレスを常に受けています。これらの複雑に絡み合った要素を培養容器内で統合的に模倣することは容易ではありません。

いかにして生体に限りなく近い環境を人工的に構築するかが、細胞培養技術の次なるブレイクスルーに向けた最大の鍵となっています。

（2）コストの高さと手技の属人化

高度な培養技術、特にiPS細胞などの幹細胞の維持や再生医療用の細胞調製には、非常に高価な成長因子を含む特殊な培地や高価なコーティング剤が必要となり、莫大なランニングコストがかかります。

また、細胞培養は研究者や技術者の「職人技」に依存する部分が大きく、ピペッティングの速度、細胞を剥がす際の酵素処理時間、細胞の分散具合など、手技のわずかな違いによって細胞の品質（生存率や分化効率）が大きくばらついてしまうことが多々あります。

これが、実験結果の再現性が得られない、あるいは再生医療の製造ラインで安定した品質管理が難しいという大きな壁となっています。

７．細胞培養の自動化

前述のような「属人化による品質のばらつき」や「人件費・労働時間の増大」という課題を低減するため、近年急速に進展しているのが細胞培養プロセスの自動化・ロボット化です。

（1）自動培養システムの導入と進化

高精度の多関節ロボットアームや自動分注機、自動搬送式インキュベーター、顕微鏡カメラシステムを統合した大規模な自動培養装置が多数開発・実用化されています。
これにより、定期的な培地の交換、細胞の画像撮影による状態監視、増殖度合いに応じた継代培養といった一連の複雑で繊細な作業を、事前に設定したプログラムに従って自動的に実行できるシステムも登場しています。システムによっては夜間や休日を問わず、細胞にとって適切なタイミングで処理を行えるため、人為的なミスを低減し、品質の均一化に大きく貢献しています。

（2）自動化のメリットと手作業との比較

自動化には多くのメリットがありますが、導入に向けたコストなどの課題も存在します。以下に手作業との比較をまとめます（表2）。

【表2　手作業による培養と自動化培養の比較】

８．将来展望

細胞培養技術は、今後も医療やバイオテクノロジーのイノベーションを牽引する重要なコア技術です。
中でも、これからの創薬や医療のあり方を根本から変えると期待されているのが「3Dオルガノイド」に関する技術です。

「オルガノイド」とは、幹細胞などを三次元的に培養することで自己組織化させ、生体内の臓器に似た構造や機能を持たせた「ミニ臓器」のことです。近年では、生きた細胞を精密に積層・配置する「バイオプリンティング」技術と組み合わせることで、血管網などを備えたより複雑なオルガノイドを作製する研究も進んでいます。

3Dオルガノイドが特に期待されている分野の一つが、新薬の開発（創薬）と動物実験の削減・代替です。
従来の二次元培養や動物実験では、ヒト特有の生体反応や薬の効き方を正確に予測することが困難でした。しかし、ヒト由来の3Dオルガノイドを用いることで、実際の臓器に近い環境で、薬剤の有効性や毒性をよりヒトの生体反応に近い条件で評価できる可能性があります。これにより、創薬における薬剤評価の精度向上や開発効率の向上が期待されるほか、動物愛護（3R）の観点から世界的に求められている動物実験の大幅な削減・代替にも大きく貢献すると期待されています（図4）。

【図4　3Dオルガノイドの可能性】

細胞培養は、単に「細胞を体外で生かしておく」技術から、細胞の能力を引き出し新たな治療法を「創り出す」技術へと進展しています。基礎知識を正しく理解し、最新のテクノロジーを柔軟に取り入れていくことが、今後の医療やバイオものづくりの進歩に大きく寄与していくでしょう。

（日本アイアール株式会社　特許調査部　K・T）

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